一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />
1、了解熟悉細(xì)胞工廠的使用，清洗及再利用的方法；
2、比較細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶同等條件下培養(yǎng)Vero細(xì)胞時(shí)各自細(xì)胞的生長狀態(tài)；
3、比較細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞加毒之后細(xì)胞的狀態(tài)變化和產(chǎn)毒情況；
4、通過實(shí)驗(yàn)分析用細(xì)胞工廠代替原有轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)優(yōu)缺點(diǎn)；
5、通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞工廠中常見問題。
二、主要實(shí)驗(yàn)工具及材料
干凈的10L轉(zhuǎn)瓶一個(gè)（表面積約為2278㎝
2）；
NUNC公司4層細(xì)胞工廠一個(gè)（表面積為2520㎝
2，編號：140360），自帶一個(gè)插拔塞和旋口塞
細(xì)胞生長液；細(xì)胞維持液；毒種（CTN-1V株工作種子批毒種）
三、實(shí)驗(yàn)過程
（一）培養(yǎng)Vero細(xì)胞，觀察分析及注意事項(xiàng)
將一瓶已長成致密單層細(xì)胞消化，制備成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，按照每ml溶液含有1×10
5個(gè)細(xì)胞數(shù)，及每平方厘米貼壁細(xì)胞數(shù)相同，根據(jù)面積比計(jì)算出加入ml數(shù)。加入細(xì)胞后放置于37℃恒溫室中培養(yǎng)。
細(xì)胞懸液濃度：2.32×10
6個(gè)/ml
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溶液總體積（ml） |
加入細(xì)胞懸液體積（ml） |
面積細(xì)胞數(shù)（個(gè)/cm2) |
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細(xì)胞工廠 |
800 |
34.48 |
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10L轉(zhuǎn)瓶 |
1500 |
31.03 |
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觀察、分析
2010-8-5
11：00 加入細(xì)胞和培養(yǎng)液于細(xì)胞工廠和10L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)
13：30 觀察：細(xì)胞工廠中的貼壁細(xì)胞數(shù)量較10L轉(zhuǎn)瓶多，溶液中含有大量的懸浮細(xì)胞
分析：細(xì)胞工廠是靜置培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁較10L轉(zhuǎn)瓶快
2010-8-6
9：10觀察
細(xì)胞工廠：細(xì)胞狀態(tài)良好，已伸展，分布均勻
10L瓶：細(xì)胞狀態(tài)一般，少許伸展，分布稍有不均
分析：10L轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞貼壁不均勻，可能是由于細(xì)胞總數(shù)較少造成
（二）加入病毒后，Vero細(xì)胞狀態(tài)的觀察分析
2010-8-9
9：30觀察（加毒前）
細(xì)胞工廠：細(xì)胞生長成致密單層，間隙很小，排列整齊，分布均勻
10L轉(zhuǎn)瓶：細(xì)胞生長成致密單層，間隙很小，排列較整齊，分布稍有不均勻
加毒前更換培養(yǎng)液為維持液，再根據(jù)比例加入3.1ml（10L轉(zhuǎn)瓶）3.4ml(細(xì)胞工廠)病毒
2010-8-10 9：00觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞無明顯變化，狀態(tài)正常，輪廓清晰
2010-8-11 9：30觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞狀態(tài)正常，無明顯病變，無懸浮細(xì)胞；10L轉(zhuǎn)瓶的顏色稍淺
2010-8-12 9：00觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞局問成拉網(wǎng)狀，有少量懸浮細(xì)胞出現(xiàn)，并且細(xì)胞工廠中的懸浮細(xì)胞較10L轉(zhuǎn)瓶多，細(xì)胞工廠中的PH維持正常，顏色無變化，10L轉(zhuǎn)瓶的PH維持不好，顏色變化明顯，PH下降明顯。
分析：細(xì)胞工廠較10L瓶透氣性好，所以PH維持得好
2010-8-13 9：15觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的懸浮細(xì)胞數(shù)量增多，大部分細(xì)胞病變明顯，成拉網(wǎng)狀
（三）收獲病毒液
2010-8-16 9：30收獲病毒液前觀察
細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶中有大量的懸浮細(xì)胞，考慮收獲病毒液。
收獲病毒液取樣：分別從細(xì)胞工廠和10L轉(zhuǎn)瓶中取樣于青霉素小瓶中，送樣檢測抗原和感染性滴度
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
抗原結(jié)果和滴度結(jié)果
此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞工廠制備的狂犬病毒液，抗的含量和感染性滴度均好于轉(zhuǎn)瓶工藝制備的病毒液。可能與下述原因有一定關(guān)系：
（1）細(xì)胞工廠為靜止培養(yǎng)法，接種細(xì)胞后細(xì)胞貼壁良好，分布與較均勻，而轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞貼壁時(shí)間較長，并且稍有不均，因此在一定時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞工廠細(xì)胞長勢稍好一些；
（2）10L瓶的細(xì)胞表面積少于細(xì)胞工廠，接種的細(xì)胞數(shù)是按面積計(jì)算，細(xì)胞工廠總細(xì)胞數(shù)多于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)；
（3）轉(zhuǎn)瓶工藝加毒時(shí)維持液1500ml，細(xì)胞工廠維持液是800ml。
因此，細(xì)胞工廠制備的病毒液的抗原含量和感染性滴度好于轉(zhuǎn)瓶工藝
在現(xiàn)有的條件下，很難找到與細(xì)胞工廠細(xì)胞生長面積和維持液體積一致的對照方法，只能以細(xì)胞附著的單位面積，加入細(xì)胞數(shù)條件控制，但維持液的量則無法控制，只能按常規(guī)方法加入。
細(xì)胞工廠每層液面均分操作：
1、將培養(yǎng)基直接倒入細(xì)胞工廠；
2、將細(xì)胞工廠朝有小口的一面放置，平衡一段時(shí)間；
3、將細(xì)胞工廠翻轉(zhuǎn)90度，帶有進(jìn)液口的一面朝上，靜置一段時(shí)間，培養(yǎng)基便會自動平均分配到每一層腔室中；
4、雙手握住進(jìn)液口的一面，緩慢地將細(xì)胞工廠放倒，變成水平放置，不要抓握**層邊緣，以防造成損壞。
注意事項(xiàng)：
1、移動細(xì)胞工廠的時(shí)候要盡量保持水平，否則會造成每層溶液不均勻；#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
2、放置細(xì)胞工廠的平臺或架子一定要水平，防止同層的細(xì)胞溶液厚度不同；
3、由于細(xì)胞工廠的進(jìn)液口是熔點(diǎn)低的材料制成，因此火焰保護(hù)時(shí)要小心，不要使之變形；
4、清洗細(xì)胞工廠時(shí)，如用水流沖洗，切忌用較急的水流沖洗，否則將造成細(xì)胞工廠的損壞；
5、清洗后的細(xì)胞工廠放到鏡下觀察，還可看到少量的細(xì)胞殘留在上面，不易清洗下來。根據(jù)G內(nèi)其它企業(yè)的經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞工廠可重復(fù)利用3-4次，但不能高壓消毒滅菌，需要通過鈷60照射之后再利用，增加成本；
6、四層細(xì)胞工廠放到鏡下觀察時(shí)，只能看到**下一層細(xì)胞的狀態(tài)。10層或40層中細(xì)胞狀態(tài)的觀察則需要用四層細(xì)胞瓶對照觀察。
五、細(xì)胞工廠較現(xiàn)在轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：1、節(jié)省人力、物力、時(shí)間、空間；
2、方便地按比例擴(kuò)增；
3、受污染風(fēng)險(xiǎn)低；
4、瓶間差異變小
缺點(diǎn)：1、可重復(fù)利用的次數(shù)較少；
2、產(chǎn)品價(jià)格較貴；
3、消毒需要用鈷60照射；
4、清洗不方便；
5、細(xì)胞工廠量較少，按二次收獲，僅收獲1600ml，而轉(zhuǎn)瓶可收3000ml；此次細(xì)胞工廠滴度較高可許與其收量低有關(guān)
六、總結(jié)
細(xì)胞工廠做為一個(gè)可用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)裝置，具有很多的方便于細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，會給整個(gè)生產(chǎn)過程節(jié)省人力，時(shí)間，空間。但是對于Vero細(xì)胞的加毒產(chǎn)毒過程還存在許多細(xì)胞問題。能否用于疫苗生產(chǎn)，還需要考慮和解決更多的難點(diǎn)。
