材料

A、儀器
1. 凈化工作臺，2. 離心機(jī)，3. 恒溫水浴箱，4. 冰箱（4℃）
5. 倒置相差顯微鏡，6. CO2培養(yǎng)箱，7. 振蕩混合儀
8. 酶聯(lián)免疫檢測儀，9. 移液槍，10. 電磁力攪拌機(jī)，11. 微孔濾器
B、玻璃器皿
1. 吸管，2. 小燒杯（100ml），3. 廢液缸，
C、塑料器皿
1. 吸頭，2. 槍頭，3. 96孔培養(yǎng)板，4. 15ml離心管，
5. 50ml離心管，6. 膠塞，
D、其他物品
1. 微量加樣槍，2. 紅血球計數(shù)板，
F、試劑
1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，
4. 雙抗（青霉素、鏈霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025%  EDTA
7. 二甲基亞砜（DMSO），
8. MTT溶液：稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4℃保存?zhèn)溆茫瑑芍軆?nèi)有效。
一、原代細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞株（系）復(fù)蘇培養(yǎng)：
（一）細(xì)胞原代培養(yǎng)
1.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法：
1）、組織塊培養(yǎng)法  
將所取得的組織用含青霉素、鏈霉素400U/ml和400ug/ml的生理鹽水漂洗2此，5分鐘/次。取出組織盡可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加兩滴小牛血清，用剪刀盡可能將其剪碎，用吸管將其泥狀的組織點(diǎn)種在培養(yǎng)瓶壁，倒置于37°、5%CO2條件下30分鐘后將培養(yǎng)瓶正置，從培養(yǎng)瓶的一端緩緩加入完全培養(yǎng)液（小牛血清15%、青霉素、鏈霉素各100U、100ug/ml），使組織塊有培養(yǎng)液與其接觸為準(zhǔn)，輕輕放置于37°培養(yǎng)。待24小時候補(bǔ)液。
或小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。 培養(yǎng)2~4小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴(yán)禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補(bǔ)液，培養(yǎng)3~5天時可換液，一方面補(bǔ)充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。
其他方法：消化分離法  、器官培養(yǎng)  略
2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法  
對于懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。  
（二）細(xì)胞株(系)細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)
細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化。
(3) 然后在無菌下取出細(xì)胞。凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。
(4)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細(xì)胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。加入的培養(yǎng)液的量依凍存的細(xì)胞數(shù)量，如果凍存數(shù)量為10⁶，則稀釋10倍使細(xì)胞達(dá)到10⁵即可。
注意事項
在細(xì)胞復(fù)蘇操作時，應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過**易受損的溫度段(-5～0℃)。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細(xì)胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細(xì)胞輕輕倒掉，再補(bǔ)以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結(jié)果。
二、細(xì)胞維持培養(yǎng)（細(xì)胞換液培養(yǎng)）、培養(yǎng)選拔常規(guī)觀察
 (一)原代細(xì)胞的維持
1、貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的換液）  
一般三天后組織塊周圍即可見梭形細(xì)胞長出。第三天換液一次，其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。若希望細(xì)胞能在較長時間內(nèi)能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。  待不同組織塊周圍的細(xì)胞連接成片時即可傳代。
2、懸浮細(xì)胞  
凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細(xì)胞不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細(xì)胞不適宜生長，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達(dá)到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。
半量換液的方法如下：  
將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內(nèi)，若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。  
（二）傳代細(xì)胞維持培養(yǎng)：同上
（三）培養(yǎng)選拔常規(guī)觀察：#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
1.培養(yǎng)液
2.細(xì)胞生長情況
3.細(xì)胞形態(tài)變化
4.污染情況
三、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：
(1)棄舊培養(yǎng)液：吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。  
(2)漂洗：每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS或HANKS液，漂洗貼壁細(xì)胞一次后倒掉。  （此步可以省略） 
(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，在倒置顯微鏡下待1/2細(xì)胞變園后加適量完全培養(yǎng)液終止?；蚣?xì)胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2～3分鐘，輕輕搖動，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時應(yīng)立即終止消化）。在37°或25°以上環(huán)境進(jìn)行消化。
 (4)終止：加入完全培養(yǎng)基適量（通常10-20%胎牛血清培養(yǎng)基）5ml，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。  
(5)離心：離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞（5-10分鐘），去除培養(yǎng)基（含胰酶及EDTA）。
(6)計數(shù)：離心前先滴好計數(shù)板待計數(shù)，計算細(xì)胞的濃度。
(7)傳代或凍存：離心后用完全培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)（可1:3**1:5傳代，在25cm2的培養(yǎng)瓶中長滿細(xì)胞可達(dá)5*10⁶/ml，經(jīng)10倍稀釋每瓶達(dá)10⁵/ml即可，25cm2的培養(yǎng)瓶每瓶5ml培養(yǎng)液）?；蛴脙龃嬉赫{(diào)整濃度（一般達(dá)1*10⁷）凍存。（ 到此步時經(jīng)證實未被細(xì)菌或真菌污染，則撤去抗生素，以免對細(xì)胞的生長長生不利影響，指原代培養(yǎng)細(xì)胞）
四．細(xì)胞凍存： 
細(xì)胞凍存液：
20%  小牛血清
10%  二甲基亞砜DMSO
70%  培養(yǎng)液
操作步驟：
1. 選對數(shù)增生期細(xì)胞（證明無支原體污染），在凍存前**換液。
2. 按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制成懸液，計數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5*10⁷/ml左右，離心，去上清液。（凍存細(xì)胞數(shù)量要充分，密度達(dá)5*10⁷/ml，在溶后稀釋20倍時，仍能保持5*10⁵ml數(shù)量）。一般25cm²的培養(yǎng)瓶滿瓶才達(dá)到10⁵.
3. 加入配置好的凍存液，與去上清液相同的量一滴一滴的加入離心管中，讓侯用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞室培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑10%二甲亞砜(DMSO)或甘油，可使冰點(diǎn)降低，使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。（細(xì)胞冷凍保存時**常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSP和90-95%原來的細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意由于DMSO稀釋時會釋放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成）
4. 分裝于無菌凍存管中，每管1.5ml懸液。
5. 旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)志。
6. 凍存：
1） 冰箱4℃放2小時，-75℃過夜，轉(zhuǎn)液氮保存，
2） 4°，0°，-20°各30分鐘（現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)P647），**后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。

附件一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況觀察

（一）細(xì)胞計數(shù)操作規(guī)程

胎盤藍(lán)法原理：（產(chǎn)品批號：T8154，T6146和Z35,962－9）
使用胎盤藍(lán)染色決定血細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)目，胎盤藍(lán)是用于染色的多種染料中能被活細(xì)胞排斥的一種染料，這種方法的成立是基于活細(xì)胞不能被染色：胎盤藍(lán)對血清蛋白比細(xì)胞蛋白有一種更強(qiáng)的親和力，如果背景太深，在計數(shù)之前細(xì)胞應(yīng)成球狀并重懸在無蛋白的培養(yǎng)基或鹽液中。
方法：
1、預(yù)先在平衡鹽液中懸浮細(xì)胞（例如：Hank’s平穩(wěn)鹽液HBSS，產(chǎn)品批號：H2513）
2、取0.5ml　0.4%胎盤藍(lán)于一試管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml細(xì)胞懸液（稀釋倍數(shù)＝5）并且混勻，允許放置5－15分鐘。
注意：如果細(xì)胞在胎盤藍(lán)中暴露時間過長，活細(xì)胞也會像死細(xì)胞一樣被染上色。
3、在血細(xì)胞計數(shù)板上蓋上蓋玻片，使用巴斯德毛細(xì)吸管或其它合適的器材取少量的胎盤藍(lán)細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計數(shù)板上的兩個小室中。將巴斯德毛細(xì)吸管小心的靠在蓋玻片邊緣，利用毛細(xì)張力充滿小室，不要過度或過少充盈。
1）從血細(xì)胞計數(shù)板的一個小室開始，計數(shù)中間和四角邊長/mm的正方形中的所有細(xì)胞數(shù)（詳見sigmaP1845的圖樣I）死細(xì)胞被染成藍(lán)色，分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)。
注意：壓線細(xì)胞的計數(shù)原則，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右（詳見sigmaP1845的圖II）
2）重復(fù)上述步驟計數(shù)第2個小室
注意：如果超過10%的細(xì)胞成串，應(yīng)重復(fù)全部程序通過吹打務(wù)必使細(xì)胞在原液中和在胎盤藍(lán)細(xì)胞懸液中一樣分散，如果在10個正方形方格中細(xì)胞數(shù)少于200個或多于500個（20－50個細(xì)胞/正方形）應(yīng)重復(fù)這個步驟，以調(diào)節(jié)細(xì)胞稀釋倍數(shù)。
3）準(zhǔn)備第二份樣品并重新計數(shù)以保證準(zhǔn)確
4）細(xì)胞計數(shù)－血細(xì)胞計數(shù)板上蓋好蓋玻片的每個正方形（指中央大方格，其長度寬度均為1mm的正方形，與蓋玻片的距離為0.1mm），總體積為0.1mm³或10^-4cm³。若1cm³近仍等于1ml，那么每毫升中集中的細(xì)胞數(shù)（和細(xì)胞總數(shù)）則可以這樣來計算。
每毫升細(xì)胞數(shù)＝每個正方形的平均細(xì)胞數(shù)´稀釋倍數(shù)´10⁴（10個正方形的細(xì)胞計數(shù)）#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
例：如果每個正方形的平均細(xì)胞數(shù)是45´5´10⁴＝2.25´10⁶個細(xì)胞/ml
總細(xì)胞數(shù)＝每毫升細(xì)胞數(shù)´**初的細(xì)胞樣品的體積
例：2.25´10⁶ (個細(xì)胞/ml) ´10ml（**初體積）＝2.25´10⁷個細(xì)胞（總細(xì)胞）
5）活細(xì)胞比例（%）＝總的活細(xì)胞數(shù)（沒染上色的）¸總的細(xì)胞（染上色的和沒染上色的）´100
例：如果每個正方形中沒染上色的（活的）細(xì)胞平均數(shù)是37.5，總活細(xì)胞數(shù)＝(37.5´5´10⁴)活細(xì)胞數(shù)/ml´10ml（**初體積）＝1.875´10⁷個活細(xì)胞，活細(xì)胞比率（%）＝1.875´10⁷（活細(xì)胞數(shù)）¸2.25´10⁷(總細(xì)胞數(shù)) ´100＝83%.
血球計數(shù)板的使用
16×25型的計數(shù)板  將計數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數(shù)（見圖二）。將每一中格放大，可見25個小格。計數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依下列公式計算：
酵母細(xì)胞個數(shù)／1mL=100個小方格細(xì)胞總數(shù)/ 100 ×400×10000×稀釋倍數(shù)或：4個中格的細(xì)胞數(shù)/4×16×10000×稀釋倍數(shù)
 
 有一種計數(shù)板的結(jié)構(gòu)為25×16，計算如下：4個中格的細(xì)胞數(shù)/4×25×10000×稀釋倍數(shù)
（二）.細(xì)胞生長曲線（細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞分裂率：略）
概念：
細(xì)胞生長曲線是測定細(xì)胞**生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個過程中細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細(xì)胞數(shù)(萬／mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。
方法：
計數(shù)法：
1．取生長良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計數(shù)(見四、細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實驗步驟)。如是非粘壁細(xì)胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計數(shù)。
2．根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果按每個小方瓶5×104／mL作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，共接種21瓶細(xì)胞。
3．24 h后開始計數(shù)細(xì)胞，以后每隔24 h計數(shù)一次，每次取3瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行計數(shù)。計算平均值。連續(xù)計數(shù)7 d。 　　
4．根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)／mL)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。
MTT法：　　
1．制備1 mL細(xì)胞懸液。空白對照以1 mL培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液。加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT還原為藍(lán)紫色甲月贊結(jié)晶。 　　
2．加1 mL DTW脫色液，37℃**少靜置30 min(甚**過液)，使甲質(zhì)顆粒充分溶解。 　　
3．吸取200 μL該溶解液**96孔板孔中，在酶標(biāo)儀上讀取OD值，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。
4．每隔24 h測量一個點(diǎn)，每個點(diǎn)為3個平行樣品的平均值。
CCK-8法：略
CCK-8法的優(yōu)點(diǎn)： 1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑； 2、CCK-8法能快速檢測； 3、CK-8法的檢測靈敏度很高，甚**可以測定較低細(xì)胞密度； 4、CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT法； 5、CCK-8法對細(xì)胞毒性?。?nbsp;6、CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。 
 CCK-8法的缺點(diǎn): 1、與MTT法相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。 2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。
（三）.活選細(xì)胞觀察：相差倒置顯微鏡使用：略
附件二：
細(xì)胞裂解液：提取RNA用
0.5%   SDS
0.1mmol/L  EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
20 ug/ml  RNase
TE:RNA、DNA溶解用
1mmol/L EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
附件三.IC50半抑制率實驗：
MTT法：
MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項：MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。
　　缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對實驗者也有損害。
MTT 溶液的配制方法
　　通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器**好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞**數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的線性，MTT 吸光度**好在0-0.7 范圍內(nèi)。#p#分頁標(biāo)題#e##p#分頁標(biāo)題#e#
　　MTT一般**好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，**好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就**不能再用了。
　　MTT有致癌性，用的時候小心,有條件**好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
　　Nacl 8g
　　Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
　　KH2PO4 0.24g　
　　調(diào)pH 7.4
　　定容1L
MTT法實驗步驟
貼壁細(xì)胞：
　　1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度**1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
　　2.、5%CO2，37℃孵育，**細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前**下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實情況
　　3.、5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
　　4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
　　5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
　　6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
　　7、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）
　　懸浮細(xì)胞：
　　1、收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預(yù)試尋找**佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對照（加100ml 1640）。
　　2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
　　3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）
　　4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。
　　5、同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。
注意事項：
（1）選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
（3）設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，**后比色以空白調(diào)零。
（4）MTT實驗吸光度**后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系，
IC50是半抑制率：
一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度. IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低,當(dāng)然也可以反向說明某種細(xì)胞對藥物的耐受程度。意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！
舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，**大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一個公式可供參考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg **大劑量
I:lg(**大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應(yīng)率之和
Pm:**大陽性反應(yīng)率
Pn:**小陽性反應(yīng)率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
公式中的**大**小陽性反應(yīng)率就是**大**小抑制率
例：
用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少M(fèi)TT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定
一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。
一般要低于IC50，避免非調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多，造成流式細(xì)胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細(xì)胞系空白處理的調(diào)亡率應(yīng)低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細(xì)胞周期的亞G0峰比較明顯。