1、培養(yǎng)目的：　神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)是研究神經(jīng)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能及其在缺血缺氧等各種損傷條件下的病理變化的重要方法之一。希望通過(guò)較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方法能較容易地培養(yǎng)出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)細(xì)胞,為研究大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)及各種與神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究提供較好的體外模型。
2、實(shí)驗(yàn)室條件：
超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱、冷凍保存裝置、細(xì)胞計(jì)數(shù)板和電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、離心機(jī)、PH計(jì)、天平、水純化裝置、高壓蒸汽消毒裝置、電熱干燥箱、過(guò)濾除菌裝置、手術(shù)器械、培養(yǎng)器皿、移液器、特殊用具、雜用品
3、培養(yǎng)方法：
   1）培養(yǎng)基的選用（含應(yīng)補(bǔ)充的附加成分）及培養(yǎng)所需的其它用液；
10 %馬血清DMEM培養(yǎng)液（含90 %DMEM 液,10 %馬血清）, 10 %馬血清,含終濃度為3～6 mmol/ L 的HEPES ,添加終濃度為6. 25 mmol/ L 的NaCl ;Neurobasal 培養(yǎng)液中含98 %Neu2robasal 液,2 % B27 添加劑,含終濃度為3～6 mmol/ L 的HEPES ,添加終濃度為6. 25 mmol/ L 的NaCl 。DHanks 液(除常規(guī)配方外,添加終濃度為6. 25 mmol/ L 的NaCl)
2）具體操作方法及步驟（按實(shí)際操作分步列出）；
1 新生24 h 內(nèi)大鼠置- 20 ℃冷凍10 min ,于無(wú)菌條件下取出兩大腦半球,置于盛有4 ℃DHanks 液(除常規(guī)配方外,添加終濃度為6. 25 mmol/ L 的NaCl) 的平皿中,在顯微解剖鏡下徹底剝?nèi)ツX膜、血管,去除腦白質(zhì),取大腦皮層并用DHanks 液漂洗兩遍,將皮層剪碎成1 mm³ 小塊(冰上操作)
2 在37℃條件下用0. 125 %胰蛋白酶消化20 min ,中間振搖1～2 次。
3 消化完全后用等體積的4℃ 10 %馬血清DMEM 培養(yǎng)液終止消化并漂洗兩遍,將細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌離心管中,加入適量的4℃10 %馬血清DMEM 培養(yǎng)液后用長(zhǎng)嘴巴氏吸管吹打數(shù)次(注意盡量不產(chǎn)生氣泡) ,靜置5min 后收集上層細(xì)胞懸液,重復(fù)上述步驟兩次。
4 將細(xì)胞懸液過(guò)70μm Zellsieb 網(wǎng)篩后,以1000 rpm 速度,離心5 min ,棄上清,
5 用10 %馬血清DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并調(diào)整密度**5 ×105 個(gè)/ ml ,接種細(xì)胞于預(yù)先涂布有0. 1 ‰多聚賴(lài)氨酸(Sigma) 的培養(yǎng)板(6 、24 孔板每孔分別接種2. 0 ml 、0. 4 ml)內(nèi),
6 于37℃、飽和濕度5 %CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),4h 后用含2 %B27 的Neurobasal 培養(yǎng)液給細(xì)胞全量換液(6 、24 孔板每孔分別1. 0 ml 、0. 3 ml) ,以后每3 d 半量換液1 次。
7 神經(jīng)細(xì)胞接種1h 后即有細(xì)胞貼壁,培養(yǎng)4h 后jue大部分細(xì)胞已貼壁,并可觀察到有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞長(zhǎng)出突起,胞體透亮,光澤明顯,細(xì)胞活性好,此時(shí)將細(xì)胞從有血清培養(yǎng)環(huán)境換成Neurobasal 無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境繼續(xù)培養(yǎng)
3）培養(yǎng)過(guò)程的觀察的注意事項(xiàng)；
①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新生24 h 內(nèi)大鼠,而可不用胎鼠
②接種細(xì)胞后用10 %馬血清DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h ,之后用Neurobasal 全量更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 要增加神經(jīng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力,預(yù)先用多聚L - 賴(lài)氨酸處理培養(yǎng)板也是關(guān)鍵之一
③Neurobasal 培養(yǎng)液滲透壓為235 ( ±10)mosM ,多用作胎鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),而用于成年大鼠神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的液體滲透壓約為260 mosM
④本方法培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞,不需額外加入阿糖胞苷等抑制膠質(zhì)細(xì)胞分裂的藥物,也能獲得較純的皮層神經(jīng)細(xì)胞,關(guān)鍵是剝離腦膜、血管、白質(zhì)要徹底。
⑤培養(yǎng)板處理方法很重要:shou先應(yīng)徹底清洗干凈,包括泡4 %硫酸清潔液及分析純級(jí)100 %乙醇;另外在培養(yǎng)孔內(nèi)放置蓋玻片(蓋片處理基本同培養(yǎng)板,只是需泡含80 %濃硫酸的清潔液) ,再用多聚賴(lài)氨酸包被蓋玻片,使神經(jīng)細(xì)胞更好貼壁生長(zhǎng),提高培養(yǎng)效果。
⑥由于神經(jīng)細(xì)胞比較嬌嫩,制備單細(xì)胞懸液過(guò)程中要求操作輕、穩(wěn),吹打時(shí)忌產(chǎn)生氣泡。另外整個(gè)制備單細(xì)胞懸液過(guò)程在冰
上進(jìn)行,能更好地保持細(xì)胞活力。
⑦整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程一定要無(wú)菌操作。
4、目的細(xì)胞的鑒定方法：
1）具體方法（可列1～3種）；大腦皮質(zhì)神經(jīng)元純度的鑒定( Nissl’s 染色)
　　將細(xì)胞爬片的小玻片用0. 01 mol/ L 的PBS 漂洗,40 g/ L 多聚甲醛固定,再用10 g/ L 甲苯胺藍(lán)染色,梯度酒精(70 %、80 %、95 %、100 %) 分色,置倒置相差顯微鏡下,隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)30 個(gè)視野(目鏡10 ×,物鏡20 ×,框面積0. 3 mm2 ) 內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。
2）應(yīng)出現(xiàn)的結(jié)果：陽(yáng)性；陰性。
　 培養(yǎng)第3 d 的神經(jīng)細(xì)胞,胞核淡染,偏于一側(cè),胞體飽滿(mǎn),藍(lán)紫色顆粒不均勻分布于胞漿中,同時(shí)可見(jiàn)胞核藍(lán)染、胞質(zhì)淡染、平鋪于板底的非神經(jīng)元。經(jīng)Ara2C 作用24 h 后,**培養(yǎng)第6 d ,可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞胞體增大,胞質(zhì)內(nèi)尼氏顆粒增多,非神經(jīng)細(xì)胞明顯減少,神經(jīng)元純度可達(dá)92 %以上,便可用于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。
5、困難及解決辦法：
1）  獲得較純的皮層神經(jīng)細(xì)胞：熟悉大鼠的大腦局部解剖，剝離腦膜、血管、白質(zhì)要徹底，操作過(guò)程中動(dòng)作輕柔。
2）在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段器清洗器械時(shí)要細(xì)致認(rèn)真。若忽略培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)小的雜質(zhì)，可導(dǎo)致在培養(yǎng)過(guò)程中一些雜質(zhì)也在瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)
        3）自身專(zhuān)業(yè)技能不熟練，吹打是過(guò)多氣泡產(chǎn)生，無(wú)菌觀念不強(qiáng)等原因，在培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞死亡。