1.培養(yǎng)基DMEM  ++丙酮酸鈉++10%血清++青鏈霉素
2.復(fù)蘇：
（1）37度融化后，擦干凍存管 酒精擦，細(xì)胞加入15ml離心管，加5ml培養(yǎng)基，500g離心5min，棄上清，加1ml培養(yǎng)基重懸后加入到培養(yǎng)瓶中，5~6ml左右，記得晃勻。
3. 傳代  吸出舊培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滾2遍吸出，37度放1min左右計(jì)時(shí)，看到變圓即加入新培基吹打 ，幾下就好了，分到新瓶里。
 
我個(gè)人認(rèn)為：293細(xì)胞貼壁后形成圓形，可能是細(xì)胞本身狀態(tài)不是很好，細(xì)胞不夠飽滿(mǎn)，細(xì)胞的貼壁后的棱角不易顯露出來(lái)，所以看上去類(lèi)似圓形，而且細(xì)胞較小。 
293細(xì)胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5 E1區(qū)的人胚腎亞三倍體細(xì)胞系，是一種E1區(qū)缺陷互補(bǔ)細(xì)胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。293細(xì)胞是貼壁依賴(lài)型呈上皮樣細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型，細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種：貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)。這三種方式均可用于293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。293細(xì)胞在無(wú)Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長(zhǎng)，也可生長(zhǎng)在血清濃度降低的培養(yǎng)基中。單層培養(yǎng)細(xì)胞在5-10％FBS-DMEM中能生長(zhǎng)很好。一般來(lái)講，1:10傳代后，一周可以長(zhǎng)滿(mǎn)。嚴(yán)禁過(guò)度生長(zhǎng)，這點(diǎn)很重要。因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致細(xì)胞密度加大和堆積，影響病毒斑的形成和轉(zhuǎn)染，傳代時(shí)也不易打散。懸浮的293細(xì)胞很容易大規(guī)模培養(yǎng)，但不容易長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。293細(xì)胞在傳代120次以后，其表型可能改變，生長(zhǎng)狀況不再完全是單層的了，偶爾會(huì)形成局部的細(xì)胞成團(tuán)聚集，應(yīng)立即拋棄，重新引入新傳代的細(xì)胞。
293細(xì)胞培養(yǎng)特性：
 1、293細(xì)胞明顯適應(yīng)酸性環(huán)境,pH值在6.9～7.1時(shí),可順利貼壁生長(zhǎng), 換液時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基。
2、傳代：倒去廢液，PBS洗一次（輕），用0.02%EDTA與0.25%Trypsin消化，生長(zhǎng)良好細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中輕搖,使之流遍所有細(xì)胞表面,即將其吸除或棄去消化30s，然后吸去，再讓剩下的EDTA/Trypsin作用30s,鏡下觀察細(xì)胞變圓,就可加DMEM終止消化，反復(fù)吹打**細(xì)胞全成單個(gè)懸浮細(xì)胞即可。12小時(shí)-24小時(shí)90%以上細(xì)胞貼壁。293細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá)80-90%匯合，傳代比例為1：3。
3、293細(xì)胞在低代時(shí)容易貼壁，生長(zhǎng)良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團(tuán)，且貼壁不牢，用PBS沖洗時(shí)即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細(xì)胞懸液，**好購(gòu)入時(shí)先大量?jī)龃妗?br /> 4、復(fù)蘇　293細(xì)胞的另一生長(zhǎng)特性是貼壁所需時(shí)間長(zhǎng)且貼壁不牢。細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇時(shí),都有不同程度的腫脹,若以50ml培養(yǎng)瓶待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底的70%～80%時(shí)消化凍存,復(fù)蘇時(shí)將其全部接種**2個(gè)50ml瓶中時(shí)較為合適。剛復(fù)蘇的293貼壁很慢，復(fù)蘇接種后24小時(shí)內(nèi),應(yīng)盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)或不作觀察,以免因晃動(dòng)而影響細(xì)胞貼壁。復(fù)蘇后48小時(shí)左右觀察貼壁情況并進(jìn)行**更換培養(yǎng)基比較合適,如果用一次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細(xì)胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱。
5、轉(zhuǎn)染：體外應(yīng)用293細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，如果是采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染，一定要注意293細(xì)胞不要全部長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞時(shí)加入磷酸鈣就會(huì)使293細(xì)胞大片的脫落，**好是當(dāng)293生長(zhǎng)到1/2或2/3時(shí)進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染，可以避免細(xì)胞的大量脫落。
 
其它的經(jīng)驗(yàn)：1、用大瓶培養(yǎng)較小瓶要好，可能是更有利于293均勻的分布，利于營(yíng)養(yǎng)的攝取
2、培養(yǎng)液要新鮮，每次只配1000ml，分為2-4瓶，不用的培養(yǎng)液，凍存在-20度，
3、要及時(shí)傳代，**好是細(xì)胞基本鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部，但是細(xì)胞之間還沒(méi)有完全貼緊，總是多少有空隙的時(shí)候**好。
4、如果細(xì)胞貼壁不好，可能是消化過(guò)久，或是培養(yǎng)瓶不夠干凈，當(dāng)然要除外細(xì)胞污染。
5、如果使用用玻璃培養(yǎng)瓶或皿，可以采用高壓滅菌的0.2%明膠溶液預(yù)處理培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿，方法是將明膠加入培養(yǎng)皿，使之浸泡到底面的各個(gè)部分，然后吸出，置超凈臺(tái)內(nèi)晾干即可使用。這樣處理后細(xì)胞貼壁效果好且鏡下細(xì)胞立體感強(qiáng)。如果是新的塑料培養(yǎng)瓶就不用處理。
 
培養(yǎng)基；GIBCO DMEM粉劑，加雙抗，HEPES，NaHCO3
配置高糖的DMEM培養(yǎng)基1000ml，
1.一袋DMEM培養(yǎng)基（GIBCOBRL)用去離子水溶解
2.加入NaHCO3 2.0g
3.加入谷氨酰胺 0.146g（終濃度為5mM）
4.加入青霉素10萬(wàn)U（終濃度100u/ml），鏈霉素6.5萬(wàn)U（終濃度100u/ml）
5.定容900ml
6.過(guò)濾除菌、分裝到兩個(gè)消毒的500ml瓶子中
7.加入滅活小牛血清100ml。
 
 
 
L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。
 
脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有**終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時(shí)加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時(shí)應(yīng)加溫30℃，完全溶解后過(guò)濾除菌，分裝**小瓶，儲(chǔ)存于－20℃。使用時(shí)，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
 
DMEMF11培養(yǎng)液――取15．6 g DMEMF11溶于700～800 mL超聲水中，加入3．7 g NaHCO3，用1 mol／L HCI或1 tool／L NaOH調(diào)節(jié)pH值**7．0～7．2，加超聲水定容**1 000 mL，0．22 p,m濾膜過(guò)濾，根據(jù)需要加入5％ ～10％胎牛血清。
檸檬酸鹽細(xì)胞消化液――50 g KCI、22 g檸檬酸鈉加超純水**500 mL即為10×檸檬酸鹽細(xì)胞消化液，高壓蒸氣消毒(1．034×lo5 Pa)15 min后4℃冰箱貯存。臨用前以無(wú)菌超純水稀釋l0倍即為1×檸檬酸鹽細(xì)胞消化液。
低代次293細(xì)胞培養(yǎng)基的配制DMEMF11 90 mL加FBS 10 mL，再加入青霉素和鏈霉素終濃度為100 U／mL。即為10％FBS的293細(xì)胞培養(yǎng)基。
細(xì)胞的復(fù)蘇 快速取出凍存的低代次293細(xì)胞，將其安剖的底端1／2浸于37℃水浴中，輕輕晃動(dòng)以加速融解。在超凈工作臺(tái)中，以70％ 乙醇對(duì)細(xì)胞安剖表面消毒，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移**75 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入10 mL低代次293細(xì)胞培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6～8 h后待細(xì)胞貼壁更換培養(yǎng)基。這與傳統(tǒng)的方法——離心洗滌后再轉(zhuǎn)人培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)不同。
細(xì)胞的傳代 待細(xì)胞的融合度**90％ ，以1：2的比率傳代。shou先吸出培養(yǎng)基，然后加入1×檸檬酸鹽細(xì)胞消化液3～5 mL洗2遍，留取0．5 mL 37℃消化5～10 min。將培養(yǎng)瓶在桌面輕輕敲打使細(xì)胞脫壁、漂浮、分散，為使細(xì)胞進(jìn)一步分散可輕輕吹打幾次。然后加入培養(yǎng)基3 mL，溫和混勻，分別取1．5 mL細(xì)胞懸浮液加入2個(gè)25 cm 培養(yǎng)瓶中，再加入2 mL低代次293細(xì)胞培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞的凍存 待細(xì)胞融合度**90％左右，吸出培養(yǎng)基以1×檸檬酸鹽細(xì)胞消化液消化分散細(xì)胞，方法同細(xì)胞傳代。加入5 mL培養(yǎng)基中和消化液，200×g離心5 rain收集細(xì)胞沉淀，再以1 mL細(xì)胞凍存液(90％FBS+10％DMSO)重懸，一70℃或液氮中凍存。

文獻(xiàn)報(bào)道，該細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不容易貼壁，生長(zhǎng)活力低，易造成損傷，而且隨著傳代次數(shù)的增加包裝病毒的生物學(xué)特性會(huì)丟失。在培養(yǎng)過(guò)程中為減輕細(xì)胞損傷，可：
(1)利用低代次293細(xì)胞貼壁的特性，在復(fù)蘇和傳代時(shí)不離心，而是加入10 mL培養(yǎng)基中和細(xì)胞消化液，培養(yǎng)6～8 h，細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基，從而避免了離心剪切力對(duì)細(xì)胞造成的機(jī)械損傷；
(2)在消化細(xì)胞時(shí)，振蕩培養(yǎng)瓶，避免直接反復(fù)劇烈吹打細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)觀察、貼壁率和生長(zhǎng)曲線表明，這種方法對(duì)細(xì)胞損傷小，能維持細(xì)胞較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
NG等研究表明，低代次293細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中傳代時(shí)融合度過(guò)高或過(guò)低，其整合的腺病毒El區(qū)基因易丟失；另外，不適當(dāng)?shù)膫鞔嚷室矔?huì)導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變。為此，筆者把細(xì)胞傳代的融合度控制在90％左右，傳代比率l：o以腺病毒感染質(zhì)粒pFG140感染傳l0代以后的低代次293細(xì)胞，可成功包裝出腺病毒，表明這種傳代方法可較好保持細(xì)胞的生物學(xué)特性。
本人也做過(guò)一段時(shí)間的293細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)時(shí)是用來(lái)擴(kuò)增腺病毒的。看了樓主的描述，我覺(jué)得不貼壁與你3小時(shí)后的擾動(dòng)關(guān)系不大。我倒是覺(jué)得你種細(xì)胞的濃度太 大。為什么要將15瓶的細(xì)胞收集起來(lái)再分別種于8個(gè)培養(yǎng)皿呢？濃度太大了。要知道293長(zhǎng)到一定程度（>80％）的時(shí)候細(xì)胞的特性會(huì)發(fā)生變化。我一 般是將一瓶細(xì)胞懸浮，分別種于于2-3個(gè)培養(yǎng)皿中，然后讓其生長(zhǎng)到80-90％滿(mǎn)，加入病毒原液。等到所有細(xì)胞變圓飄起就說(shuō)明擴(kuò)增過(guò)程完成了。這樣培養(yǎng) 293在轉(zhuǎn)染前的狀態(tài)是**好的，對(duì)病毒擴(kuò)增**有利！不像你的方法，一下種那么密，就算都能貼壁，那時(shí)的細(xì)胞密度已經(jīng)接近80-90％，況且細(xì)胞都是才傳代 的，狀態(tài)肯定沒(méi)有稀釋培養(yǎng)法好。另外，給你個(gè)重要的提示：293細(xì)胞很容易吹打下來(lái)。不需要使用胰酶，反復(fù)吹打即可。長(zhǎng)到80％的細(xì)胞更容易吹下來(lái)！胰酶 對(duì)293細(xì)胞的傷害很大，即使你的消化時(shí)間很短。